马铃薯手脚要紧的食粮作物，具有极大的市集需求量，约70%的马铃薯产区集会溜达于西北、西南、华北、东北等地，是当地农民的主粮作物和要紧经济收入着手[1]。频年来麻生希吧，疮痂病在各大产区广博发生且逐年加重，发病率多在10%以上，局部区域高达100%[2]，经济失掉可达10%−40%[3]，已成为制约我国马铃薯产业发展的关节问题[4]。
马铃薯疮痂病由多种致病链霉菌(Streptomyces spp.)引起，主要危害块茎[5]。发病初期表皮出现褐色雀斑，后期逐步扩大为样式不规章的疮痂状斑块，导致发病部位组织木栓化，影响其外不雅和商品价值[6]，严重时会形成深度达到7−10 mm的褐色坑状病斑[7]，利于其他病原菌的侵入，从而形成大幅减产[8]。已报说念的病原菌种类多达20余种，其中溜达最广、最具代表性的病原菌是疮痂链霉菌(Streptomyces scabies) [9]，休耕轮作、耕作绿肥、增施有机肥等农业法子是当今缩小疮痂病危害的要紧妙技[10]，但受东说念主口浩繁、耕地资源有限和比拟效益相反等身分的截至，上述法子均难以大面积实行。东说念主们对化学药剂进行了多数筛选，发现2， 4-二氯苯氧乙酸、Capitan等能有用减低疮痂病危害，但会危及泥土生态、引起马铃薯减产[11]。频年来，对环境友好的生防菌逐步成为防控马铃薯疮痂病的规划热门。石莹莹等[12]从云南昭通薯田泥土均分离的苏云金芽孢杆菌YN-2-2盆栽稽察防效为36.11%；赵永龙等[13]从广东省惠东县病薯田土样中得回了3株解淀粉芽孢杆菌HZ11-4、HS-12和HZ13-1，它们对马铃薯袖珍薯疮痂病的防效分散为68.57%、57.15%和65.96%；陈志垚等[14]从黑龙江省王人王人哈尔市克山农场得回一株贝莱斯芽孢杆菌BKS104，其盆栽稽察相对防效达到85%。此外，木霉菌属、链霉菌属、假单胞菌属、丝核菌属等微生物复合菌剂在部分区域马铃薯疮痂病防控中展现出较好的后果[15]。但现存生防菌的环境适合性存在一定局限[16-17]，从且我国马铃薯产地溜达世俗，生态环境相反昭彰，亟须补充适当不同泥土生态的菌种资源。
本规划以S. scabies为靶标微生物，从泥土中筛选对其具有昭彰拮抗功能的细菌，明确其分类地位，分析其对马铃薯疮痂病的防治后果，评价其环境适合性，以期为马铃薯疮痂病的有用防控提供优良的菌种资源。
色情直播 1 材料与法子 1.1 材料 1.1.1 病原菌及泥土样品疮痂链霉菌(S. scabies)菌株购自中国科学院微生物规划所菌种收藏惩处中心，馆藏编号CGMCC4.1765 (以下简称4.1765)；大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)由本执行室分离保存，编号为V991；尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，馆藏编号CGMCC3.18025；立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，馆藏标号CGMCC3.2888。泥土样品采自广东省惠州市惠东县铁涌镇马铃薯病薯名义，泥土的理化性质为：pH 5.9，全氮1.70 g/kg，全钾19.82 g/kg，总磷1.54 g/kg，有机质33.73 g/kg，真菌7.83×103个/g，放线菌1.87×107个/g，细菌1.53×107个/g。
1.1.2 主要试剂和仪器细菌理化性质检测试剂盒，北京兰伯瑞生物科技有限公司。显微镜：显微镜数码采集装配购自北京长恒荣创科技有限公司；日立冷场辐射扫描电子显微镜购自Hitachi公司。Biolog GENIII毅然板1030，北京兰伯瑞生物科技有限公司。
1.1.3 培养基PDA培养基(g/L)：土豆200.0，琼脂15.0，葡萄糖20.0，更始其pH值至7.0−7.2。LB培养基(g/L)：卵白胨10.0，酵母索求物5.0，NaCl 10.0，更始其pH值至7.0−7.2。King氏培养基(g/L)：卵白胨20.000，K2HPO4 1.725，丙三醇0.015，MgSO4·7H2O 1.500，色氨酸0.100，更始其pH值至7.2。比色液配方：取1 mL浓度为0.5 mol/L的FeCl3缓缓加入30 mL的浓硫酸中，用玻璃棒搅动均匀。B5养分液(g/L)：KNO3 50.0，MgSO4·7H2O 5.0，NaH2PO4·H2O 3.0，CaCl2·2H2O 3.0，(NH4)2SO4 2.7，FeSO4·7H2O 5.56，EDTA·Na2 7.46，H3BO3 3.0，MnSO4·4H20 10.0，ZnSO4·7H2O 2.0，NaMoO4·2H2O 0.25，CuSO4·5H2O 0.025，CoCl2·6H2O 0.025，KI 0.75，pH值调至5.5，添加蒸馏水定容至1 L。
1.2 法子 1.2.1 拮抗菌的分离取1 g土样置于50 mL离心管，加入10 mL蒸馏水，颠簸使泥土均匀悬浮。吸取100 µL 10−3、10−4、10−5稀释液滴至LB固体培养基并均匀涂布，28 ℃培养24 h，挑选单菌落划线纯化，将得回的菌株接种于LB液体培养基中，于37 ℃、200 r/min颠簸培养过夜备用。
1.2.2 拮抗菌的筛选取100 µL疮痂链霉菌孢子悬浮液均匀涂布于PDA固体培养基，吸取6 µL细菌培养液滴于上述培养皿中央，28 ℃共培养7 d后测量抑菌圈直径。在4 ℃、4 500 r/min离心15 min，分散汇集参试菌株的培养上清液和菌体千里淀，用等量无菌水从头悬浮菌体，以LB液体培养基为对照，将培养上清液、菌体悬浮液和培养液同期进行平板相持稽察，培养48 h后不雅察并纪录抑菌圈的直径。
1.2.3 拮抗菌时势不雅测将待测菌液均匀涂布于LB固体培养基，37 ℃培养24 h，不雅察菌落的时势特征，并用显微镜数码采集装配LV2000拍照纪录时势特征，遴荐日立冷场辐射扫描电子显微镜SU8010不雅察菌体时势，测量10个菌体大小。
1.2.4 拮抗菌革兰氏染色将待测菌液滴至载玻片受骗然晾干，轻细烘烤固定菌体，滴加草酸铵结晶紫试剂，染色1 min后用水冲洗，碘液染色1 min再次冲洗，用95%酒精消失，滴加番红复染3−5 min，水洗后进行镜检。
1.2.5 菌株生理生化特色分析遴荐Biolog GENIII毅然板1030毅然菌株可利用碳源；用试剂盒测试细菌的理化性质(具体操作见评释书)；构兵酶稽察参照《常见细菌系统毅然手册》[18]麻生希吧。
1.2.6 菌株耐盐碱特色规划将待测菌株分散接种至pH值为3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，NaCl含量为1%、3%、5%、7%、9%、11%的LB培养基中，37 ℃、200 r/min颠簸培养12 h后测定其OD600值。
1.2.7 菌株HD9-1对多种化学农药的明锐性测试参考李建萍[19]的规划法子，遴荐K-B纸片扩散法评价见识菌株对多种药物的明锐性。依据参试药批评释书配制责任浓度(具体参数见表 4)，将直径8 mm的无菌圆形滤纸片分散置于药品溶液中浸泡30 s，然后将滤纸片扬弃于涂有HD9-1的LB固体培养基上，以无菌水处理为对照，37 ℃培养12 h，字据是否出现抑菌圈评价菌株HD9-1的药敏性。
1.2.8 菌株的广谱拮抗性测定分散在PDA培养基上接种大丽轮枝菌、立枯丝核菌和尖孢镰刀菌，在其两侧隔断1 cm责罚别接种6 μL HD9-1培养液，并以单独接种病原菌的处理为对照，28 ℃培养4 d不雅察抑菌后果。抑菌率(%)=(对照组面积−处理组面积)/对照组面积×100。
1.2.9 菌种16S rRNA基因序列测定将细菌培养液送至北京博迈德生物工程股份有限公司，愚弄16S rRNA基因片断通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)进行PCR。PCR响应体系(20 µL)：2×T5 Super PCR Mix 10 µL，HD9-1基因组DNA (200 ng/μL) 2 µL，正、反向引物(10 µmol/L)各1 µL，ddH2O 6 µL。PCR响应要求：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个轮回；72 ℃ 10 min。测序终局在National Center for Biotechnology Information (NCBI)上通过BLASTn进行比对查找与HD9-1相同性较高的序列，用MEGA 7.0软件构建菌株系统发育树。
1.2.10 盆栽稽察在直径大小为17 cm的花盆中装满蛭石，每盆移栽马铃薯品种夏波蒂的脱毒试管苗3株，置于光照强度为50 000 lx、光周期为L16 h/D8 h的要求下培养。10 d后在每株幼苗的根部打针1×107 CFU/mL的S. scabies孢子悬浮液10 mL，培养10 d后每盆均匀浇施1×108 CFU/mL拮抗菌悬浮液30 mL。以未接种任何菌种的处理手脚空缺对照Control 1，仅打针S. scabies的处理为阳性对照Control 2，每个处理重叠3次，依据马铃薯疮痂病分级圭臬统计病情指数、发病率，并计较防治后果。
病害分级圭臬：马铃薯皮无缺，无病斑，为0级；表皮病斑面积为大于0小于1/6，为1级；表皮病斑面积为大于1/6小于1/3，为2级；表皮病斑面积为大于1/3小于1/2，为3级；表皮病斑面积大于1/2，为4级。
发病率(%)=发病块茎数/探问总块茎数×100；
病情指数=∑(各病级块茎数×该病级数代表值)/(探问个体总数×最高病级数)×100%；
相对防效(%)=(对照组病情指数–处理组病情指数)/对照组病情指数×100。
1.2.11 菌株促助长特色分析参照李振东等[20]法子分散配制终浓度为0.02、0.04、0.06、0.08和0.2 mg/mL的吲哚乙酸(indoleacetic acid， IAA)圭臬液，将圭臬液与比色液等量搀杂，昏黑培养30 min，测定其OD530值，以IAA浓度为横坐标、OD530为纵坐标绘图IAA浓度的圭臬弧线；吸取100 μL待试菌液接种于King氏液体培养基，37 ℃、200 r/min颠簸培养48 h，5 000 r/min离心10 min汇集上清液，遴荐SalKowski比色法定性检测菌液中的IAA含量。
在直径大小为17 cm的花盆中装满蛭石，每盆移栽马铃薯品种夏波蒂的脱毒试管苗3株，置于光照强度为50 000 lx、光周期为L16 h/D8 h的要求下培养7 d后每盆均匀浇施1×108 CFU/mL的拮抗菌悬浮液30 mL，以加入30 mL无菌水处理为对照，分散于室温培养0 d、14 d时统计马铃薯株高。
1.2.12 数据处理遴荐Origin 2019b和Excel 2016软件处理关连数据。
2 终局与分析 2.1 马铃薯疮痂链霉菌拮抗菌的分离与筛选从采自广东省惠州市惠东县的薯田泥土均分离出一株对S. scabies具有昭彰拮抗后果的细菌，编号为HD9-1，其培养液的抑菌圈直径达到31 mm (图 1A)。
HD9-1培养上清液、菌体悬浮液和培养液同期进行平板相持稽察，抑菌后果如图 1B所示，菌体悬浮液与培养液抑菌圈直径分散达到23.1 mm与23.5 mm，大小畸形，而上清液未出现抑菌圈，标明其代谢产物中无抑菌活性物资。
2.2 菌株HD9-1时势学特征如图 2所示，HD9-1的菌落呈圆形，淡黄色，不透明，名义干燥，角落较为整王人；菌体杆状，两头钝圆，宽度约为0.75 μm，长度为1.0–2.5 μm，革兰氏染色呈阳性。
2.3 菌株HD9-1生理生化特色表 1终局裸露，HD9-1可利用蔗糖手脚独一碳源，不成利用葡萄糖、甘霖醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、阿拉伯糖和蜜二糖，不错合成明胶酶使明胶液化，其代谢产物还可降解苦杏仁苷；不错合成β-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和脲酶；不错利用柠檬酸钠；能以丙酮酸盐手脚底物合成乙酰甲基甲醇，但不成解析硫代硫酸钠产生H2S气体。
2.4 基于16S rRNA基因序列的分子系统学分析以HD9-1的基因组DNA为模板，利用通用引物扩增见识基因片断，序列已上传至NMDC数据库(登录号：NMDCN00011OJ)。其序列在National Center for Biotechnology Information (NCBI)进行比对，发现与Bacillussp. THY-159、Bacillus velezensis PR189、Bacillus subtilis QB928和Bacilus subtilis RUB的相同性达99.9%以上。愚弄MEGA 7.0软件构建系统发育树，发现HD9-1与Bacilus subtilis RUB在湮灭分支(图 3)。聚拢时势学和生理生化特色分析终局，将菌株HD9-1毅然为枯草芽孢杆菌。
2.5 菌株HD9-1对马铃薯疮痂病防控后果盆栽稽察共收成马铃薯袖珍薯31粒(图 4)，其中，水处理Control 1收成的10粒袖珍薯均未发病；病原菌S. scabies处理Control 2收成的11粒袖珍薯中，未发病小薯仅1粒，达4级的病薯7粒，占63.64%，总发病率达到90.91%，病情指数为79.55；病原菌S. scabies与拮抗菌HD9-1共处理组收成的10粒袖珍薯中，未发病小薯3粒，占30%，1级病薯4粒，占40%，4级病薯仅1粒，占10%，总发病率为70%，病情指数32.50，相对防效为59.15% (表 2)。
2.6 菌株HD9-1对高温及盐碱环境的耐受性菌体悬浮液分散经37、60、80 ℃处理30 min后，平均活菌数分散为1.6×109、6.0×108、1.2×106 CFU/mL，100 ℃处理30 min后仍有1.5×104 CFU/mL的菌体存活(表 3)。可见HD9-1可耐受100 ℃傍边的高温，环境适合性较强。
图 5终局标明，HD9-1在NaCl含量为3%的要求下可平淡助长，在NaCl含量7%−9%的要求下OD600值为0.45，生物量约为LB培养基(NaCl含量1%)的60%；在NaCl含量为11%的要求下，菌体可自便助长，OD600值约为0.10。HD9-1的最适pH值为7.0，在pH 5.0和pH 9.0的要求下，OD600值可达0.56以上，生物量约为LB培养基的75%，在pH 3.0的高偏酸和pH 11.0的高偏碱要求下，菌体仍可自便助长，培养过夜的OD600值约为0.1。由此猜测，菌株HD9-1在中国南边和朔方偏酸和偏碱性泥土均能适合[21]。
2.7 菌株HD9-1对多种化学农药的明锐性表 4数据裸露，HD9-1对中生菌素、苯醚甲环唑、氟菌·霜霉威、春雷霉素、氟硅唑、吡唑醚及嘧菌酯和甲基硫均不解锐，猜测HD9-1不错在上述药品存在的环境中使用，但代森锰锌和氟啶胺会扼制HD9-1的助长。
2.8 菌株HD9-1的广谱拮抗性图 6终局标明，仅接种大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的对照组，28 ℃培养4 d后病原菌可平淡助长，菌落面积分散为4.27、22.75和8.02 cm2；而接种HD9-1发酵液的处理组，病原菌助长均受到不同程度的扼制，菌落面积分散为0.91、3.38与6.41 cm2，HD9-1对大丽轮枝菌、尖孢镰刀菌和立枯丝核菌的抑菌率分散约为78.67%、85.14%和16.34%。
由此可知，HD9-1不错拮抗多种病原菌，其广谱拮抗性有待进一步挖掘。
2.9 拮抗菌促助长特色毅然IAA的测定经常遴荐SalKowski比色法。图 7A为吸光度值530 nm要求下绘图的圭臬弧线。培养液与比色液搀杂静置后，对照组无色透明，而HD9-1则逐步呈现出粉红色(图 7B)，标明菌株产IAA，对比圭臬弧线计较可知，其IAA的浓度约为3.44 mg/L。
盆栽稽察终局标明，添加HD9-1培养14 d后，土豆苗株高为13.82 cm，较对照增高了2.88 cm；助长速率为0.47 cm/d，跨越对照0.13 cm/d (图 8)。
3 究诘与论断在马铃薯分娩中，耕作户为了追求产量和效益而过量施肥用药的倨傲广博存在。化肥与农药的不对理施用导致泥土生态失衡，以疮痂病为代表的土传病害逐年加重，不仅形成宽敞的经济失掉，也严重胁迫中枢产区产业(尤其种薯产业)的可抓续发展。东说念主们开展马铃薯疮痂病防控规划已有100多年历史，但于今尚未取得首要结巴，未援救出可限制化应用的殊效化学药剂过火他法子[22-23]。主要原因是病原菌为稀奇的链霉菌，土传兼种传，种类多达20余种，在不同生态区相反化溜达[24-25]。现存的生防菌种质资源十分匮乏，且结识性和生态适合性差，难以大鸿沟实行[26]。
使用化学药剂及微生物制剂是当今缓解马铃薯疮痂病危害的主要法子，规划者利用棉隆和辣根素水剂熏蒸泥土，对疮痂病的防效可达80%傍边，关联词防治后果与泥土质量密切关连，且跟着熏蒸次数的增多，泥土中有毒物资含量也权臣升高，严重影响农家具品性[27-28]。王丽玮等[29]发现链霉菌PBSH9虽能较好地扼制疮痂病，但对气温明锐，在28 ℃时抑菌活性最好，当温度低于25 ℃或高于31 ℃时其抑菌后果缩小30%，难以在复杂的大田环境中应用。郭凤柳等[30]报说念的枯草芽孢杆菌B1过火代谢产物均可扼制疮痂链霉菌的助长，但当培养技能特出6 d后其抑菌活性下跌50%。枯草芽孢杆菌的生防机制主要包括竞争作用、拮抗作用、溶菌作用、带领植物产生抗性和促进植物助长等[31]。曹君等[32]发现枯草芽孢杆菌通过养分竞争扼制病原菌的助长，有规划解说枯草芽孢杆菌与病原菌共培养时会分泌出新的抗菌物资[33-34]。HD9-1的发酵滤液中无抑菌活性物资，摈弃了其通过胞外平直分泌抗菌物资兑现抑菌的可能性，其机制有待进一步深远规划。
本文从广东薯田泥土均分离、筛选的枯草芽孢杆菌HD9-1，对S. scabies的抑菌圈直径达到31 mm，盆栽检核对马铃薯疮痂病的相对防效达59.15%，在拮抗菌接种量左右的情况下昭彰高于防效为40%的规划终局[35-36]。菌株耐高温、耐盐碱，具有精炼的环境适合性和促助长特色麻生希吧，对常用化学农药不解锐，对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和大丽轮枝菌等植物病原菌有昭彰的扼制后果，应用远景精炼。为了加速其产业化、限制化进度，尚需开展不同生态马铃薯产区的田间小区稽察和大田示范，确信其环境适合性和防病后果，并优化其发酵工艺，比拟不同碳源、氮源、接种量、温度、通气量等对HD9-1的助长繁育过火抑菌活性的影响，筛选出适当工场化发酵的培养基配方和培养要求。